FFF02 C5891-50無縫克隆試劑盒是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)，該技術(shù)突破傳統(tǒng)，不依賴內(nèi)切酶和連接酶，不受限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制，利用同源重組的原理，可將任何DNA片段克隆至任何載體的任何位點(diǎn)。反應(yīng)及轉(zhuǎn)化時(shí)間短，陽性率高。
FFF02 C5891-50的原理可以概括為三步反應(yīng)：
1、T5核酸外切酶從DNA片段的5’端切割一條鏈，產(chǎn)生的單鏈DNA末端兩兩配對(duì)，形成一個(gè)有間隙的環(huán)狀DNA；
2、DNA聚合酶通過DNA合成填補(bǔ)間隙，產(chǎn)生一個(gè)只有缺刻的環(huán)狀DNA；
3、TaqDNA連接酶通過形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺刻，得到一個(gè)完整的雙鏈DNA，也就是構(gòu)建完成的載體。
FFF02 C5891-50的突出優(yōu)點(diǎn)：
?。?）構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此是真正的"無縫克隆"；
?。?）可通過一個(gè)反應(yīng)將一個(gè)或多個(gè)片段快速、定向地插入到載體的任何位置；
?。?）待插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無須酶切；
?。?）插入片段的大小范圍寬，從20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；
?。?）可通過PCR擴(kuò)增獲得線性化載體，因此限制性內(nèi)切酶消化并不是克隆所必須的；
（6）酶催化的重組連接反應(yīng)非?？焖俸透咝?；
（7）只有插入片段和線性化載體的末端才能發(fā)生同源重組，可以有效避免非特異性的同源重組。
